细(xi)胞转染（Transfection）是指(zhi)将(jiang)DNA或(huo)者RNA导入真核细胞中的过(guo)程。转染的(de)目(mu)的是产(chan)生重组蛋白，或特异(yi)性增(zeng)强或抑(yi)制(zhi)转染细胞中(zhong)的基因表达(da)。
根据导入的核(he)酸存在于宿主(zhu)细胞的时间长(zhang)短(duan)，可以(yi)分为(wei)瞬(shun)转(zhuan)和(he)稳(wen)转。
| 瞬转 |
稳转 |
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导(dao)入的DNA没(mei)有(you)整(zheng)合到(dao)基(ji)因组中，而(er)是保(bao)留在细胞(bao)核上 |
导入的DNA整合到基因组中 |
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导入的遗(yi)传(chuan)物质不传递到子代； 遗传改(gai)变只是(shi)暂(zan)时的 |
导入的遗传物质(zhi)能(neng)够(gou)代(dai)代相传；遗传改变是永(yong)久的 |
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不(bu)需(xu)要选择(ze)性筛选 |
需要(yao)选(xuan)择性筛选出稳定转染的细胞 |
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DNA载体和RNA都可(ke)用(yong)于瞬时(shi)转染 |
只(zhi)有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身(shen)不能稳定地导入细胞中 |
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导入的遗传物质的高(gao)拷贝(bei)数导致(zhi)高水平的蛋白质表达。 |
单拷贝数(shu)或低拷贝数的稳定(ding)整合的DNA导致较(jiao)低(di)水(shui)平的蛋(dan)白(bai)质表(biao)达。 |
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通(tong)常(chang)在转染(ran)后(hou)24-96小时内(nei)收获(huo)细胞。 |
需要2-3周的时间筛(shai)选出稳定转染的细胞克隆。 |
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通常不适合(he)使(shi)用具(ju)有诱(you)导型启(qi)动子的载(zai)体(ti)的研究。 |
适(shi)用于使用带(dai)有诱导型(xing)启动子(zi)的载体的研(yan)究。 |
1、材(cai)料
293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青(qing)霉素(双抗(kang))、FCS(小牛(niu)血(xue)清)、PBS(磷(lin)酸盐(yan)缓冲(chong)溶(rong)液)、胰酶/EDTA消(xiao)化液(ye)、转染试剂(ji)(TransFast)
2、器(qi)材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头(tou)酒精灯、废液缸、血球计数板(ban)、涡(wo)旋振(zhen)荡器、恒温水浴箱、台(tai)式离心机(ji)、35mm培(pei)养(yang)皿(min)、转染管、15ml离心管(guan)、观察用倒置(zhi)显(xian)微(wei)镜荧光显微镜(jing)和CCD
3、实验步骤
细胞传代
(1)试验(yan)准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭(mie)菌)，酒精(jing)棉球，废液缸，试管架(jia)，微量(liang)移(yi)液器，记(ji)号笔(bi)，培养皿，离心管。
(2)弃掉(diao)培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加(jia)入1mlTrypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2)。用手(shou)轻拍培养瓶(ping)壁，观察(cha)到细胞完(wan)全从壁(bi)上脱落下来为止(zhi)。
(4)加入1ml的含血清培养基终(zhong)止反应。
(5)用Tip头多次吹(chui)吸，使细胞完全分(fen)散(san)开(kai)。
(6)将培养液装(zhuang)入离(li)心(xin)管中，1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一(yi)个35mm培养皿。
(8)将合适体积(ji)完全培养液加入离心管中，混匀(yun)细胞后轻(qing)轻加入培养皿中，使其均匀分布(bu)。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第(di)二天(tian)转染。
