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原位杂交
             荧光原(yuan)位(wei)杂交(FISH

一、           组(zu)织标(biao)本(ben)的准(zhun)备

组织(zhi)标本经甲(jia)醛固(gu)定(ding)24-48h,常(chang)规脱(tuo)水(shui)、透(tou)明、浸(jin)蜡(la)和(he)包(bao)埋(mai);4μm石(shi)蜡切(qie)片,贴(tie)在涂(tu)有(you)APES胶(jiao)的(de)干净载(zai)玻(bo)片(pian)上。58℃烤8-24hISH试剂(ji)的配制(zhi)(所有试(shi)剂和用(yong)具(ju)均(jun)用DEPC水处(chu)理(li))。

二、操(cao)作(zuo)流程:

一(yi)、杂交(jiao)片的前(qian)处理

1、常规(gui)脱蜡至(zhi)水。

20.01mol/L,pH8.0 EDTA(0.02 mol/L,pH8.0TB配(pei)制  8℃ 煮 15min;

3、自(zi)然(ran)冷(leng)却(que) 15min,蒸馏水洗(xi)2-5min;

42μg/ml蛋(dan)白(bai)酶K(TE配制) 室温(wen) 4min, 0.1mol/L甘(gan)氨(an)酸PBS10min.

5、蒸(zheng)馏水洗2-5min;

675%,85%,95%,100%酒(jiu)精(jing)系列(lie)脱水各(ge)1min

二(er)、杂(za)交

将荧(ying)光(guang)标记(ji)探针(zhen)加(jia)入48ul无(wu)RNAas PBS溶(rong)解(jie),用杂交液(ye)(4×SSC,25%去(qu)离(li)子(zi)甲酰(xian)胺(an), RNAas PBS1:200稀释(shi),20ul杂交液并(bing)覆(fu)盖,55℃杂交90min, 37℃杂交:24h

三(san)、杂交后洗涤(di)(洗涤过程(cheng)应避光)

(1)将(jiang)切片浸入杂交后洗涤缓(huan)冲液的洗缸(gang)中(zhong)72 30min(洗缸应(ying)提(ti)前30min放(fang)入72水浴(yu)锅(guo)内预(yu)热(re)到(dao)722×10min

★杂交后(hou)洗涤缓冲(chong)液:2×SSC/0.3% NP-40

20×           

蒸馏水                       

                          

最后体(ti)积(ji)                    

1N NaOH调(diao)pH7.0-7.5

(2)2×33min

0.4×33min

70%乙(yi)醇(chun)洗 1min

(3)每(mei)片滴(di)加10μ  封(feng)片衬(chen)染(ran)5min

(4)不(bu)及(ji)时(shi)观察,可将切片保存(cun)在-20冰(bing)箱暗(an)处,观察(cha)时复(fu)温至室温即(ji)可(ke)。

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