分(fen)子克(ke)隆与质粒(li)载(zai)体构建
一、服务介(jie)绍(shao)
分子克隆(long)是(shi)在分子水(shui)平(ping)上提供(gong)一种(zhong)纯(chun)化(hua)和扩(kuo)增(zeng)特(te)定(ding)DNA片段(duan)的(de)方(fang)法(fa)。常(chang)含(han)有目(mu)的基(ji)因(yin)，用(yong)体外重(zhong)组方法将它(ta)们(men)插入克隆载体，形(xing)成(cheng)重组克隆载体(ti)，通过(guo)转化与转导(dao)的方式，引(yin)入适合的寄(ji)主(zhu)体内得到复(fu)制(zhi)与扩增，然后再(zai)从筛(shai)选(xuan)的寄主细胞(bao)内(nei)分离(li)提(ti)纯所(suo)需(xu)的克隆载体，可(ke)以(yi)得(de)到插入DNA的许(xu)多(duo)拷(kao)贝(bei)，从(cong)而获得目的基因的扩增。
二(er)、实(shi)验原理
外源DNA与载体分子的连(lian)接就(jiu)是DNA重组(zu)，这(zhe)样(yang)重新(xin)组合的DNA叫做重组(zu)体或重组(zu)子。重组(zu)的DNA分子(zi)是在DNA连接酶的作(zuo)用下(xia),有Mg2+、ATP存在的连接(jie)缓冲系(xi)统中(zhong)，将(jiang)分别(bie)经(jing)酶切(qie)的载体分子与外(wai)源(yuan)DNA分子进(jin)行(xing)连接。DNA连接酶(mei)有两种：T4噬菌(jun)体DNA连接酶和大肠(chang)杆(gan)菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都(dou)有将两(liang)个(ge)带(dai)有相同(tong)粘(zhan)性(xing)末(mo)端的DNA分子连在一起的功(gong)能，而(er)且(qie)T4噬菌(jun)体DNA连接酶还(hai)有—种大肠杆菌连接酶没(mei)有的特性，即(ji)能(neng)使两个平末端(duan)的双(shuang)链(lian)DNA分子连接起来。但(dan)这种连接的效率比(bi)粘性末端的连接效率(lv)低(di)，一(yi)般(ban)可通(tong)过提高T4噬菌(jun)体DNA连接酶浓(nong)度(du)或增加(jia)DNA浓度来提高(gao)平末端的连接效(xiao)率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反(fan)应(ying)分为(wei)3步(bu)：，T4DNA连接酶与(yu)辅助(zhu)因子ATP形成酶—AMP复合物；然(ran)后，酶—AMP复合(he)物(wu)再结合到(dao)具(ju)有5’磷酸基和(he)3’羟基切口的DNA上，使(shi)DNA腺苷(gan)化；后(hou)产生一个新的磷酸二酯(zhi)键(jian)，把(ba)切口封(feng)起(qi)来(lai)。
DNA重组的方法主要(yao)有粘端连接法和平端连接法，为了防止(zhi)载体本(ben)身的自(zi)连，可以通过(牛小(xiao)肠碱(jian)性磷酸(suan)酶)CIP处理(li)克服。
连接反应的温(wen)度在37℃时(shi)有利(li)于(yu)连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢(qing)键结(jie)合是不稳(wen)定的。因此(ci)人们找(zhao)到了(le)一个折(zhe)中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜(ye))，这样既(ji)可大限度地(di)发挥(hui)连接酶的活性，又(you)兼(jian)顾(gu)到短(duan)暂配(pei)对(dui)结构(gou)的稳定。
三(san)、实验(yan)流程
目的DNA的扩增和纯化；
连接反应；
电(dian)泳(yong)检(jian)测(ce)连接产物。
四、客户(hu)提供
样本DNA，基因序列(lie)，试(shi)剂(ji)盒(he)。
五(wu)、公(gong)司提供
构建好(hao)的载体，电泳胶(jiao)图(tu)，测序(xu)结果(guo)。
实验周(zhou)期(qi)：大约1-2月(yue)。
